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提quzu织qi官RNA|金牌娱le注册多样品zu织匀浆机lai实验 返回

发布时间:2020-07-24 10:54

  样品zu织RNA的提qu实验:zheci实验的样品zu织主要有xiaoshu的ge个zu织qi官(如肝zang,肌rou,脂fang等)和ren肿瘤标本(如结直肠癌,肺癌,乳腺癌)


  多样品zu织匀浆机研磨xiao果tu


  1.首先要gen据需要抽提的zu织样品的质量jia入相应的TRIZOL液体,同时jia入若gankebu锈竮hong1臼笛槭襶i般情况如下:(xiaoshuzu织jia入TRIZOL,结直肠癌标本jia入TRIZOL)


  注yi:


  a.需shi先预冷试管座


  b.yong金牌娱le注册匀浆机进行匀浆处理时样品体ji最好bu要超过TRIzol体ji10℅)


  2.把jia入样品,TRIZOL,bu锈竮hong腁xygene EP管放入shi先预冷好的试管座謝iao;鷔i设置好can数盖上盖zi,点ji运行


  3.机qi运行wan毕后,da开盖zi,拿出金牌娱le注册EP管仔细观察zu织的研磨情况,如果mei有明显的块譪i铮琻ajiu可以进入下yi步实验步骤,如果mei有wanquandasui,还需要把EP管放入试管座中,继续匀浆。有些坚硬,或者脂fang含量高的zu织(乳腺)可能需要稍微长yi点的时间,时间可以依据zu织实际的研磨情况lai调zheng匀浆时间。


  4.和传统的TRIZOL提quRNA的方法yi样,将匀浆样品zai室蝜u胖眉阜zhong樱瑂hi核酸蛋白复合物wanquan分li。


  5.每shiyong1ml TRIzoljia入0.2ml氯仿,剧烈振荡若gan秒,室蝜u胖眉阜zhong印Ⅻ/p>

  6.2-8℃10000×gli心十几穤hong印Q贩治猻an层:di层为黄色有机相,上层为无色水相和yi个中间层。


  7.把水相zhuan移dao新管中,如要分liDNA和蛋白质可保留有机相,进yi步操作见后。yongyi丙醇沉淀水相中的RNA。每shiyong1ml TRIzoljia入yi丙醇,室蝜u胖眉阜zhong印Ⅻ/p>

  8.2-8℃10000×gli心10穤hong樱琹i衝a翱碽u出RNA沉淀,li心后zai管侧和管di出xian胶zhuang沉淀。移去上清。


  9.yong75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每shiyong1ml TRIzol至少jia1ml 75℅乙醇。2-8℃bu超过7500×gli心几穤hong樱锨濉Ⅻ/p>

  10.室蝜u胖胓an燥或真空抽ganRNA沉淀,大yue晾5-10穤hong蛹纯伞u要真空li心gan燥,过于gan燥会导致RNA的溶解性大大降低。jia入无RNase的水,yong枪头xida几ci,55-60℃放置10穤hong觭hiRNA溶解。如RNAyong于meiqie反应,wushiyongSDS溶液。


chang见问题分析:


  1、DNA污ran:


  A.样品匀浆时jia的蕐ue亮縯ai少


  B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或jian性溶液


  2、得lv低:


  A.样品lie解或匀浆处理bu彻di


  B.RNA沉淀未wanquan溶解


  C.检测xiguangdu时,RNA样品mei有溶于水,而溶于了TE謝iao5蚻izinongdu和低pH值条件下A280值pian高


  D.样品匀浆时jia的蕐ue亮縯ai少


  E.匀浆样品时未zai室蝜u胖眉阜zhong尹/p>

  F.xiqu水相蔮ei烊肓擞谢唿/p>

  3、RNA絛ao狳/p>

  A.zu织qu出后mei有ma上处理或冷冻


  B.待提quRNA的样品mei有保存于-60至-70℃,而保存zai了-5至-20℃


  C.细胞zaiyong胰mei处理时过du


  D.溶液或li心管未经RNase去除处理


  E.电yong时shiyong的甲quanpH值低于了3.5


预防RNase污ran注yishi项:


  1.配zhi溶液应shiyong无RNase的水


  2.经chang更换衛v痔祝琾i肤上chang带有的细菌,霉菌可能成为RNase的lai源。


  3.shiyong灭过菌的RNAzhuanyong塑liaozhi品避mian交叉污ran。


  4.RNAzaiTRIzol蕐ue林惺眀u会beiRNase污ran,但提qu后继续处理过程中应shiyongbu含RNase的塑liao和玻璃qi皿。


  本实验已经研磨的ge个zu织中发xian肝zangzu织是最容易研磨,研磨xiaolv是最好的。


  下tuA是RNA经过传统的液dan研磨和匀浆qi研磨法抽出的RNA跑胶tu,结果很明显发xianzhezhong方法是可行的,是可以dai替传统的方法的。


  液dan研磨和匀浆qixiao果


  下tuB是利yongzu织匀浆qi对xiaoshu的ge个zu织进行匀浆抽出的RNA跑胶tu。发xianzai抽提ge个zu织的RNA的时候也是可行的。


  zu织匀浆qi对xiaoshu研磨xiao果


  tuC是利yongzu织匀浆qi对ren结肠癌标本进行了研磨后抽提出的RNA的跑胶tu。


  zu织匀浆qi对ren结肠癌研磨xiao果


  tuD蕅iehu的肝zangzu织经过手工研磨和机qi匀浆后,最后抽提得dao的RNA进行了nongdu的测定,结果shuo明zu织匀浆qi抽提出得RNA的nongdu要显zhou高于传统的手工的方法得dao的RNA。


  手工研磨和机qi匀浆xiaoshu肝zang研磨xiao果


蛋白质的提qu:


  A.gen据需要抽提的zu织样品的质量jia入相应的蛋白质lie解液(如RIPA),同时jia入3kebu锈竮hong#▁iaoshu肝zangzu织jia入1mlRIPA蛋白lie解液,ren结直肠癌zu织jia入500ulRIPA蛋白lie解液)


  B.把jia入样品,蛋白lie解液,bu锈竮hong腁xygene EP管放入shi先预冷好的试管座謝iao;鷔i设置好can数盖上盖zi,点ji运衳iaoⅫ/p>

  以下同上RNA的操作方法


  最终suo得dao的蛋白质nongdu的测定经过BCA蕐ue梁胁舛╳an成的,同时通过SDS-PAGE后经过考ma斯亮蓝ran色和western blot检测都发蟴hi湟却车姆椒ǜ黬ia简便快捷,bu容易引起交叉污ran。


  更多实验细节可致电工作ren员!

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